Als der Präsident der Vereinigten Staaten nur knapp einem Attentat entgeht, das von einem teleportierenden Mutanten ausgeführt wurde, steht es nicht gut um die Rechte der Mutanten, für die sich Professor Charles Xavier (Patrick Stewart) seit jeher einsetzt. Während er zusammen mit Cyclops (James Marsden) Magneto (Ian McKellen) in seiner Gefängniszelle aufsucht, da er in ihm den Drahtzieher vermutet, suchen Jean Grey (Famke Janssen) und Storm (Halle Berry) den vermeintlichen Attentäter. Wie es sich herausstellt, sind sowohl er, Kurt Wagner alias Nightcrawler (Alan Cumming), als auch Magneto Opfer einer Manipulation geworden. Die Fäden hält ein gewisser General William Stryker (Brian Cox) in der Hand, der über eine Droge verfügt, die die Mutanten zeitweilig für seine Zwecke gefügig macht. Stryker treibt dabei ein ganz persönliches Motiv an, alle Mutanten zu vernichten. Während er Professor X und Cyclops gefangen nimmt, startet seine Spezialeinheit einen Großangriff auf die Schule der Mutanten. Nur dank des erbitterten Widerstandes von Wolverine (Hugh Jackman), Colossus (Daniel Cudmore), Rogue (Anna Paquin), Iceman (Shawn Ashmore) und Pyro (Aaron Stanford) verhindern sie Schlimmeres. Derweil gelingt Magneto dank einer spektakulären Befreiungssaktion seitens Mystique (Rebecca Romijn) die Flucht aus seinem Verlies. Er bietet den X-Men Hilfe bei der Verfolgung Strykers und der Befreiung des Professors an, die diese nur mehr als widerwillig annehmen. Doch die Zeit drängt: Stryker will Professor X mittels der Droge dazu bringen, kraft Cerebro alle Mutanten ausfindig zu machen und auszumerzen. In einer finalen Konfrontation mit Stryker erfährt Wolverine wertvolle Details zu seiner Vergangenheit als Logan. Bevor sich die X-Men retten können, muss einer von ihnen aber noch ein folgenschweres Opfer bringen…